Diagnose is gebaseerd op basis van klinische symptomen van ontsteking van de testis en/of epididymis (inspectie en palpatie van het scrotum). Echobegeleide fijne naaldaspiratie (FNA)van de testes en epididymis gevolgd door cytologie en bacteriologie kunnen een bacteriële oorzaak bevestigen. De vaststellingen op cytologie zijn de volgende: mature spermatozoa in de aanwezigheid van een grote hoeveelheid polymorfonucleaire leukocyten en bacteriën. Alhoewel er met een FNA slechts een minimaal trauma veroorzaakt wordt kan een FNA aanleiding geven tot een verspreiding van de infectie naar de aanpalende weefsels. Deze diagnose techniek wordt bijgevolg niet heel frequent gebruikt bij de aanwezigheid van een acute inflammatie.

Een derde mogelijkheid om tot een diagnose te komen is een sperma-afname. Aangezien honden met orchitis vaak veel pijn hebben t.h.v. deze regio is het echter vaak onmogelijk om sperma te verzamelen. Een sperma-onderzoek bestaat uit een macroscopisch en een microscopisch onderzoek. Bij het macroscopisch onderzoek wordt er gekeken naar het volume, de kleur, de aanwezigheid van abnormale bijmengingen en eventueel ook naar de viscositeit en de geur. Zo kan er bij orchitis als bijmenging bij het ejaculaat pus aangetroffen worden. Het microscopisch onderzoek bestaat uit het beoordelen van de motiliteit, de concentratie en de morfologie. Als laatste kan er ook nog een bacteriologisch onderzoek uitgevoerd worden. Is het mogelijk om sperma te verzamelen dan wordt er een cultuur gemaakt voor aerobe bacteriën, Mycoplasma spp. en Ureaplasma spp. Een groei van meer dan 10000 bacteriën per millimeter van 1 bepaalde bacteriesoort is significant. Een belangrijk probleem met deze techniek is dat de infectie niet exact gelokaliseerd wordt en zich zowel in de testes, de epididymidi en de prostaat kan afspelen.